Raport științific și tehnic - Proiect 112CI/2017

Produs nutraceutic funcțional cu proprietăți curative și paliative obținut din Zonar (lactoser) îmbogățit cu principii bioactive naturale prin utilizarea unor tehnologii eco-inovatoare.

Durata proiectului: 5 luni (25/07/2017 - 31/12/2017)

Obiective generale

Obiectivele proiectului ECO-ZONAR vizează rezolvarea următoarele aspecte: Caracterizarea componentelor biochimice bioactive și a proprietăților fizicio-chimice ale Eco-Zonarului prin metode analitice specifice (HPLC); Determinarea raportului optim între cantitatea de Zonar (în ml) și concentratul obținut din rădăcină de Zingiber officinalis (în mg) respectiv miere polifloră (în ml), în scopul sinergizării maxime a proprietăților curative și paliative ale produsului final;mStudiul proprietăților biologic active (curative și paliative) ale Eco-Zonarului pe modele experimentale realizate in vivo, constând în: Studiul efectelor clinice, hematologice, biochimice și histologice ale consumului de Eco-Zonar pe șoareci CD1 și șobolani Wistar (dieta de 7 zile și 21 de zile); Studiul proprietăților antioxidante ale Eco-Zonarului pe un model de stres oxidativ indus experimental la șobolani Wistar (dietă 7 zile și 21 zile); Studiul proprietăților detoxifiante ale EcoZonarului pe un model de chimioterapie cu doxorubicină în carcinomul de colon C26 inoculat la șoareci din linia BALBc; Studiul proprietăților imunostimulatoare (specifice și nespecifice) ale dietei cu Eco-Zonar.

Rezumat

Ipoteza de lucru pe care se bazează proiectul ECO-ZONAR este fundamentată pe rolul central al eco-inovației în promovarea competitivității economice ca sursă de bunăstare și echilibru social. Proiectul ECO-ZONAR contribuie prin specificul activităților și rezultatelor preconizate la o mai eficientă utilizare a resurselor și la creșterea competitivității economice, prin utilizarea unor subproduse de origine animală la obținerea de produse funcționale nutraceutice cu proprietăți curative și paliative (lactoserul zonar), utilizate în variate domenii ale medicine. Prin produsul Eco-Zonar obținut, proiectul va contribui la o mai eficientă și rațională utilizare a resurselor, convertind un subprodus al industriei laptelui într-o sursă de beneficii pentru sănătatea omului. Produsul ECOZONAR este obținut prin utilizarea unor tehnologii eco-inovatoare din Zonar îmbogățit cu principii bioactive extrase din Zingiber officinalis și miere polifloră. Valoarea lui curativă și paliativă a fost testată pe diferite modele experimentale (detoxifiant, antioxidant, hipoglicemiant și antiprooliferativ) realizate pe animale de laborator. Rezultatele cercetării vor stimula valorificarea potențialului industriei ecologice, generând eco-inovație și competitivitate, produse și servicii eco-inovatoare, și implicit crearea de noi locuri de muncă, iar produsul nutraceutic functional dezvoltat va constitui o sursă prețioasă de beneficii curative și paliative. Necesitatea identificată în acest context derivă din faptul că produsul Eco-Zonar necesită, pentru a fi implementat pe piață, efectuarea unor experimente riguros controlate care să confirme valoarea științifică a proprietăților curative și paliative a principiilor bioactive conținute, și respectiv sinergismul lor funcțional pe modele realizate in vivo.

Obiectivul 1: Caracterizarea componentelor biochimice bioactive și a proprietăților fizicio-chimice ale Eco-Zonarului prin metode analitice specifice (HPLC);

Caracterizarea componentelor bioactive și a proprietăților fizico-chimice ale produsului Eco-Zonar (Zonar cu Ghimbir și Miere) a evidențiat prezența apei în cantitate de 94,6% și a substanței uscate de 5,4%, valori care se încadrează în limitele specifice determinate pentru toate produsele pe bază de Zonar. De asemenea, din buletinele de analiză efectuate rezultă concentrații relativ mari ale proteinelor bioactive (α-Lactalbumina=1,040g/L, βlactoglobulina A=0,0824g/L și B=0,213 g/L, și BSA=0,119 g/L) în probele de lactoser investigate, rezultat care este concordant cu datele din literatura de specialitate (Beaulieu și col., 2006), care explică propritățile funcționale ale acestor peptide în consolidarea homeostaziei metabolice și imunitare, respectiv în prevenirea și controlul evoluției unor boli la om și animale (Tsutsumi și col., 2014). Determinarea macro și oligomineralelor a evidențiat prezența unor cantități semnifcative de Ca++ (268,57 mg/dL), K+ (559,28 mg/dL), Fe++ (2,51 mg/dL), Zn (0,97 mg/dL) sau P (373,51 mg/dL), cu impact asupra funcționării normale a celulelor și sistemelor majore ale organismului animal.

Caracteristici fizico-chimice ale produsului Eco-Zonar (Zonar cu Ghimbir și Miere polifloră)

W(cal) [Valoare energetică (kcal) - calorii lactate]
Valoarea energetică a fost calculată cu suma proteinelor analizate mai sus.

W(cal) / 100 ml = 0.14604 x 4.1 + 0.1 x 9.3 + 4.737 x 4.1 = 20.95 kcal

Analiza HPLC-UV a proteinelor bioactive din probele de lactoser

Analiza proteinelor bioactive din produsul Eco-Zonar [α-lactalbumin, BSA (bovine serum albumin), β-lactglobulin A, β-lactglobulin B] s-a realizat prin metoda HPLC cu detector UV-Vis.

Separarea s-a efectuat pe o coloana specifică de tip core shell, pentru separarea proteinelor și a peptidelor bioactive, utilizând o fază mobilă gradient care conține o soluție de 0,1% acid trifluoracetic în apă și o soluție de acetonitril în apă acidulată. Detecția s-a realizat la o lungime de undă de 214 nm. Prelucrarea probei. Proba de zonar cu ghimbir și miere a fost diluată, proteinele nesolubile au precipitat cu acetonitril, după care proba a fost centrifugată, iar supernatantul rezultat a fost filtrat și injectată în HPLC. Rezultatele obținute au fost convertite in g/L, iar valorile componentelor investigate se încadrează în limitele specificate de literatura de specialitate (Beaulieu și col., 2006).

Din punct de vedere cantitativ, proteinele funcționale determinate înregistrează valori de 0,119 g/L pentru BSA, 1,046 g/L pentru α-lactalbumin, 0,213 g/L pentru β-lactglobulin B, 0,0824 g/L pentru β-lactglobulin A, concentrația de proteine totale fiind de 1.46 g/L (vezi Anexa 2 RST).

Cromatograma HPLC în cazul determinării lactozei

Determinarea cromatografică a lactozei a fost efectuată prin HPLC cu detector al indicelui de refracție (RI). Probele analizate au fost diluate, proteinele precipitate cu acetonitril, apoi proba a fost filtrată și injectată în HPLC. Pentru separare s-a utilizat o coloana cromatografică specifică, iar ca fază mobilă a fost utilizată apa ultrapură Milipore. Pe baza curbei de calibrare realizate în domeniul 20,15 1,0075 mg/mL, s-a determinat cantitatea de lactoză din probele de Zonar cu ghimbir și miere. Conform cromatrogramei din Fig 2, cantitate de lactoza determinată este de 47 g/L. Rezultatele au demonstrat utilizarea eficientă a acestei metode HPLC pentru separarea izocratică de lactoză, și analiza cantitativă a lactozei din prudusul zonar cu ghimbir cu miere, utilizând RI detectare. Metoda permite reducerea cuantificării lactozei până la 0,005% (50 ppm), iar intervalul de calibrare a cuprins concentrația cea mai ridicată a analitului găsit de obicei în lactoser (detalii privind metoda și rezultatele în Anexa 2).

Deși a fost menționat un potențial risc pentru sănătate în ce privește concentrația de nitrați și nitrit în studiile realizate de-a lungul timpului, cercetări recente demonstrează potențialul benefic pentru sănătatea omului și animalelor al acestor compuși. Prin urmare, investigarea conținutul în diferite alimente a nitraților și nitriților ar putea avea o importanță deosebită pentru siguranța alimentară, cât și pentru consumul alimentar. Cromatograma pentru soluția standard este prezentată în Fig. 3 vârful care apare la 8.20 minute este atribuit nitritilor și vârful la 9,0 minute este atribuit ionul de nitrat. In comatograma zonarului cu ghimbir și miere apar aceleasi pic-uri de nitrit si nitrat de Na. Cromatograma din Fig. 3 indică 12.9 mg/L nitrit de Na si 1.18 mg/L nitrat de Na (detalii în Anexa 2).

Studiul in silico a proteinelor majore si minore din Eco-Zonar

Scopul studiului a constat în interogarea genelor/proteinelor majore (beta-lactoglobulina, alfa-lactalbumina, IgG, Albumina serica, gamma-macropeptide, protein mai putin abundente-LAP) din compozitia Eco-Zonarului. Aceste protein/peptide vor fi ulterior folosite in validarile experimentale (detalii privind metoda și rezultatele în Anexa 2.2). Au fost investigate in silico proteinele din Zonarul cu Ghimbir și miere polifloră (comparativ cu Zonarul și un lactoser commercial, în baze de date UniProt – pentru identificarea:

• secventei de aminoacizi și lungimea secventei de aminoacizi, - functiile moleculare in care sunt implicate proteinele.

Analiza in silico a fost efectuata pentru proteinele/peptidele alergene din zer (betalactoglobulina, alfa-lactalbumina, albumina serica, lactoferin). Analiza alergenilor din proteinele serice din zer de vaca – au importanta în etichetarea corecta a acestora pe produs. Alergeni identificați:

• beta-lactoglobulina (Bos d 5) și alfa-lactalbumina (Bos d 4);
• albumina serică bovină (BSA) – Bos d 6.

Pentru functiile moleculare s-a facut interogarea în KEGG si GO (gene ontology).

Obiectivul 2: Determinarea raportului optim între cantitatea de Zonar (în ml) și concentratul obținut din rădăcină de Zingiber officinalis (în mg) respectiv miere polifloră (în ml), în scopul sinergizării maxime a proprietăților curative și paliative ale produsului final

Pentru determinarea raportului optim între cantitatea de Zonar (exprimată în ml), concentratul obținut din rădăcină de Zingiber officinalis (exprimată în ml) și miere polifloră (în ml) au fost preparate 3 amestecuri conținând cantități diferite din cei 3 constituienți investigați, după cum urmează:

1. 10 litri Eco-Zonar = 8,84 litri Z + 1 litri concentrat de Ghimbir + 0,16 l/160 g Miere;
2. 10 litri Eco-Zonar = 9,20 litri Z + 0,66 litri concentrate de Ghimbir + 0,14 l/140 g Miere;
3. 10 litri Eco-Zonar = 9,56 litri Z + 0,34 litri concentrate de Ghimbir + 0,1 l /100 g Miere;

Pentru prepararea concentratului de ghimbir se utilizează o cantitate de 3 litri de apă distilată, peste care se adaugă o cantitate de 600 grame rădăcină de ghimbir curațată și răzuită mărunt. Amestecul rezultat se omogenizează și se fierbe timp de 30 minute până culoarea devine ușor verzuie, după care se filtrează/decantează partea lichidă și se pune la răcit. La final se adaugă cantitatea specificată de miere polifloră, și se conservă în condiții de temperatură controlată. Pentru stabilirea metodei de preparare și a raportului dintre componentele care au fost incluse în compoziția EcoZonarului, în principal în ce privește prepararea concentratului din rădăcină de ghimbir, am utilizat informațiile prezentate detaliat în monografia editată de European Medicine Agency (Community herbal monograph on Zingiber officinale Roscoe), EMA/HMPC/749154/2010, Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC), precum și alte studii din literatura de specialitate (Ahmad și col., 2015). După finalizarea procedurii de preparare a extractului din rădăcină de ghimbir, au fost preparate 3 produse pe bază de Zonar, ghimbir șimiere, utilizând cantitățile specificate mai sus, notate cu EcoZonar 1, Eco-Zonar 2 și Eco-Zonar 3. Într-o fază ulterioară, cele 3 produse au fost administrate la șobolani Wistar și șoareci CD4, pentru determinarea efectelor clinice și paraclinice benefice și a eventualelor consecințe nocive (efecte adverse) provocate de dieta cu Eco-Zonar timp de 21 de zile.

Obiectivul 3: Studiul proprietăților biologic active (curative și paliative) ale Eco-Zonarului pe modele experimentale realizate in vivo

Studiul proprietăților funcționale nutraceutice ale componentelor bioactive conținute de Zonarul cu Ghimbir și miere (Eco-Zonar) a fost realizat atât pe animale sănătoase clinic (șoareci CD4 și șobolani Sprague-Dowley), cât și pe animale sănătoase tratate cu două medicamente citostatice (Doxorubicina și Carboplatinul), respectiv pe două modele animale de boală (ex: ascita Ehrlich la șoareci Swiss, și carcinomul de colon la șoareci BALB/c) tratate cu Doxorubicină.

A3.1 Studiul efectelor clinice, hematologice, biochimice și histologice determinate de consumul de Eco-Zonar la șobolani Sprague-Dowley și șoareci CD4 clinic sănătoși;

a) Experimentul EZ-SD-112ci2017

Experimentul pe șobolani Sprague-Dowley a utilizat 20 de animale adulte, femele, distribuite în 4 loturi, a câte 5 animale per lot (n=5), respectiv : Lot 1 (n=5) a fost utilizat pentru obținerea valorilor de referință, primind o cantitate de 15g furaj granulat/animal/zi și apă ad libitum; Lot 2 (n=5) a primit o cantitate de 30 ml EZ1/administrare de 3 ori pe zi, inclusiv pe timpul nopții (90 mlEZ1/zi/animal) și 15 furaj granulat/animal/zi; Lot 3 (n=5) a primit o cantitate de 30 ml EZ2/administrare de 3 ori pe zi, inclusiv pe timpul nopții (90 mlEZ2/zi/animal) și 15g furaj granulat/animal/zi; Lot 4 (n=5) a primit o cantitate de 30 ml EZ3/ administrare de 3 ori pe zi, inclusiv pe timpul nopții (90 mlEZ3/zi/animal) și 15g furaj granulat/animal/zi. Animalele au fost evaluate zilnic din punct de vedere al comportamentului alimentar și al eventualelor reacții adverse provocate de consumul de Eco-zonar.

Săptămânal au fost determinate greutatea corporală (g/animal/lot) și glicemia, iar în săptămâna 2 și 3 au fost prelevate probe de sânge (pentru determinarea hemoleucogramei) și de plasmă pentru evaluarea profilului biochimic plasmatic (proteine totale, albumine, globuline, raport A/G, trigliceride, colesterol, HDL). Efectuarea experimentului a fost aprobată de Comisia de Bioetică a USAMV ClujNapoca (Nr. 00/.00.0000), iar Autorizarea proiectului a fost dată de DSVSA Cluj (Nr. 93/20.11.2017).

Pe parcursul perioadei experimentale nu s-au înregistrat manifestăti cu caracter patologic determinate de consumul celor 3 produse pe bază de zonar. Animalele s-au obișnuit relativ repede cu această dieta, iar consumul zilnic de zonar a variat între 30 și 80 ml/animal/zi, cu oscilații de la o zi la alta între loturile experimentale. Starea generală a animalelor s-a menținut bună pe toată durata studiului, fără să fie afectată bunăstarea și sănătatea acestora. O constatare obiectivă care s-a impus încă din primele zile era că unele animale din cadrul unui lot consumau cu plăcere produsul testat, în timp ce în cazul altora consumul era evident mult mai redus cantitativ, diferență explicată probabil de diferențele interindividuale privind preferințele alimentare, aspect care este menționat și în cazul omului (persoane pentru care consumul de lacrtoser este dificil, chiar dacă nu este vorba de o intoleranță la alctoză sau alți compuși biochimici. Din analiza datelor se constată o creștere constantă a greutății corporale (Fig. 1) la toate loturile pe parcursul perioadei experimentale. Cea mai notabilă creștere este înregistrată la lotul 4 (+44,85% la T4 față de T0), însă comparativ cu celelalte loturi în momentul T4 valorile greutății corporale s-au uniformizat într-un fel care rămâne inexplicabil.

Glicemia s-a determinat săptămânal, cu glucometru portabil (Accucheck Activa) din sânge periferic. Valorile obținute sunt reprezentate în tabelul 2 (Anexa 3) în mg/dl și mMol/L. Glicemia a fost determinată postprandial, motiv pentru care valorile obținute sunt usor crescute față de valorile de referință pentru această specie. Rezultatele măsurărilor seriate se regăsesc în tabelul 2 (Anexa 3), atât ca și valori individuale, cât și media pe loturi cu deviația standard. Valoarea glicemiei oscilează mult în timpul zilei, inclusiv stresul din timpul recoltării probelor contribuie la creșterea nivelului acetui parametru. În cazul lotului 3 (Fig. 3 și 4 din Anexa 3) se observă cea mai constantă creștere procentuală a glicemie față de lotul 1 (Martor) la fiecare recoltare. Având în vedere cantitatea crescută de lactoză din produsul EZ, se poate concluziona că animalele din lotul 3 au consumat o cantitate mai mare de EZ, care a dus la creșterea glicemiei. Pe durata monitorizării glicemiei, valorile cele mai crescute s-au observat la lotul 4 la T4, media glicemiei fiind de 135,4±10,45mg/dl.

Pentru examenul hematologic s-a recoltat sânge la T0 pentru stabilirea valorilor bazale, iar la sfârșitul experimentului pentru a investiga efectul consumului de EZ asupra hemoleucogramei. Pentru acestă determinare s-a recoltat 0,2 ml de sânge integral pe anticoagulant (EDTA). , iar determinările au fost efectuate imediat după recoltare cu ajutorul analizorului automat AbacusJunior Vet. Valorile componentelor hemogramei sunt reprezentate în tabelul 3 (Anexa 3). Pe parcursul experimentului nu s-au înregistrat variații patologice ale componentelor hemogramei între loturile experimentale și nici în ce privește evaluarea în dinamică a parametrilor hematologici. Diferențele procentuale între loturi și pe parcusul experimentului sunt mici și nesemnificative statistic. În ce privește leucograma, atât numărul total de leucocite cât și formula leucocitară se încadrează în limitele fiziologice ale speciei. Diferențe procentuale între loturi există, însă fără semnificație statistică, iar diferențele înregistrate între T0 și T4 sunt minore, având în vedere că valorile sunt în limite normale.

Valoarea protienogramei s-a încadrat în valorile de referință pe tot parcursul experimentului (Tabelul 7 și 8 din Anexa 3). La T4 se înregistrează o scădere a concentrației proteinelor totale la loturile experimentale față de lotul martor, dar aceste variații sunt în limite fiziologice. Cea mai mare diferență de observă la lotul martor, unde concentrația proteinelor totale este mai scăzută cu 8.35% iar diferența înregistrată la albumine este de -3.30%, și -13.78% la globuline. Valorile parametrilor specifici pentru investigarea profilului lipidic se regăsesc în tabelul 9 (Anexa 3), marea lor majoritate fiind situate în limite de oscilație normală.Valoarea trigliceridelor a suferit o modificare mai accentuată pe parcursul experimentului, cele mai mari deferențe înregistrându-se între lotul 3 și 1 (41.49%) la T4. Determinările enzimelor hepatice (Tabelul 10 din Anexa 3) au fost efectuate la sfârșitul experimentului pentru a verifica efectul consumui de EZ asupra funcției hepatice. După cum s-a observat și prin determinarea proteinogramei, consumul de Eco-Zonar nu influențează negativ funcția hepatică. Valorile obținute se încadrează în valorile fiziologice ale specie (Fig. 11 și 12 din Anexa 3). Cea mai mare diferență între loturi s-a înregistrat la lotul 2 față de lotul 1, unde se constată o diferență procentuală între valorile ALAT de 73.71%, respectiv 77.59% la determinarea ASAT.

Experimentul EZ-CD4M-112ci2017

Modelul experimental realizat pe șobolani Sprague-Dowley a fost efectuat și pe șoareci CD4, masculi, adulți, în condițiile aceluiași protocol experimental. Au fost utilizați 20 de șoareci CD4 adulți, distribuiți în 4 loturi, a câte 5 animale/lot. Lotul 1 (n=5) utilizat ca martor pentru valori de referință, a primit furaj granulat standard în cantitate de 5g/animal/zi și apă ad libitum; Lotul 2 (n=5) a primit o cantitate de 5 ml/animal/adiministrare de EZ1, de 3 ori pe zi și furaj granulat combinat în cantitate de 5 g/animal/zi; Lotul 3 (n=5) a primit o cantitate de 5 ml/animal/adiministrare de EZ2, de 3 ori pe zi și furaj granulat combinat în cantitate de 5 g/animal/zi; Lotul 4 (n=5) a primit o cantitate de 5 ml/ animal/ adiministrare de EZ3, de 3 ori pe zi și furaj granulat combinat în cantitate de 5 g/animal/zi. Loturile experimentale au fost examinate zilnic din punct de vedere clinic, și cântărite de 4 ori la interval de 5 zile. A fost determinate glicemia la T0 (ziua 1) și T4 (ziua 14), iar la sfârșitul experimentului animalele au fost sacrificate sub narcoză cu izoofluran pentru prelevarea de sânge și plasma pentru examenul hematologic și biochimic plasmatic, respectiv de țesut (timus, splină, suprarenale) pentru determinări gravimetrice și histologice. Experimentul a fost aprobat de Comisia de Bioetică a USAMV Cluj-Napoca (Decizia nr……din data…………) și autorizat de către DSVSA Cluj (Autorizație nr. 93 din 20.11.2017). Referitor la evoluția greutății corporale, s-a produs o creștere inițială la T1 la loturile 3 (32.2±1.64 g/lot) și 4 (30±6.78 g/lot) față de lotul martor (27±4.52 g/lot), iar la finalul experimentului se observă o scădere în greutatea a șoarecilor din lotul 2 (27±3.16 g/lot) (p≤0.05), 3 (25.6±3.13 g/lot) (p≤0.05) și 4 (30.2±6.14) în comparație cu martorul (31.8±2.86 g/lot). Acestă scădere este vizibilă doar în ultima săptămână, fiind întărită și de o scădere procentuală de -15.09% la lotul 2, -19.5% la lotul 3 și de -5.03% la lotul 4 față de lotul martor (Tabel 1 și Fig. 1 din Anexa 4.1). Determinarea glicemiei la T0 evidențiază valori care se încadrează în valorile fiziologice pentru această specie (80130 mg/dl). La finalul experimentului valorile glicemiei la loturile 1, 2 și 3 se încadrează în limitele normale, în schimb se observă o creștere peste limitele normale la lotul martor (163.6±26.50 mg/dl), acesată creștere putând fi atribuită stresului de manipulare. Referitor la daterminările gravimetrice efectuate, se constată o scădere a greutății timusul la lotul 2 (- 76.08%) , 3 (- 82.34%) și 4 (- 78.58%) față de lotul martor. Acestă scădere este evidentă și în valorile medii a loturile supuse dietei cu EZ (Tabel 3 și Fig. 5, 6 din Anexa 4.). Nu sunt diferențe în cee ace privește greutatea splinei între loturile experimentale, însă se poate observa o scădere a greutății suprarenalelor apropiată la loturile 2 și 3, de -49.15%, și o creștere procentuală de 103.39% la lotul 4, în comparație cu lotul martor. În ceea ce privește valorile componentelor leucogramei (Tabel 4 și Fig. 7 din Anexa 4.1), toate datele obținute se încadrează în intervalul de referință al speciei. Totuși la lotul 4 se observă cea mai mare diferență procentuală (31.8%) la numărul total de leucocite față de lotul martor. Același aspect se observă și în cazul formulei leucocitare, exceptând lotul 2, la care se observă o ușoară scădere a granulocitelor (2,68%) și a celulelor medii (15,96%) față de lotul 1. Valorile obținute la determinarea hemogramei indică valori normale a hematiilor, hemoglobinei și a hematocritului (Tabel 6, Fig. 9 din Anexa 4.1).

Se pot observa diferențe procentuale între lotul martor și loturile 2,3 și 4, însă diferențele sunt sub 6% și nu prezintă semnificație statistică. Nici în cazul valorilor plachetare nu se înregistrează valori patologice (Tabel 7, Fig. 12 din Anexa 4.1). Totuși este evidentă o valoare mai mică a numărului de trombocite cu -22,77% la lotul 4 față de lotul martor, respectiv -14,77% la lotul 2 față de lotul 1.

c) Experimentul EZ-CD4F-112ci2017

Experimentul realizat pe șoarcei CD4, femele, este o reproducere identică a studiului prezentat mai sus, atât în ce privește alcătuirea loturilor de animale, cât și protocolul experimental utilizat, respectiv investigațiile efectuate, și în bună măsură rezultatele obținute, care înregistrează variații minore de la un lot la altul, încadrându-se invariabil în limitele de variați specifice pentru această specie.

Concluzii

Consumul celor 3 produse pe bază de zonar-ghimbir și miere nu afectează în mod negativ starea de sănătate a animalelor, și nici bunăstarea și homeostazia acestora. Acest lucru este reflectat de ritmul constant al creșterii corporale și de absența diferențelor majore între loturile experimentale în ce privește evoluția greutății corporale. La nivel hemotologic nu se constată variații care să marcheze răspunsuri patologice la consumul de eco-zonar, atât în ce privește parametri eritrocitari, leucocitari și trombocitari, cât și profilul biochimic plasmatic, respectiv funcția ficatului și nivelul enzimelor serice determinate la șobolanii Sprague-Dowley. Nici la loturile de șoareci CD4 (M și F) nu s-au înregistrat manifestări cu character patologic, însă consumul de EZ (raportat la consumul de apă al lotului martor) a fost mult redus (maxim 5 ml/zi), ceea ce poate constitui un indiciu că șoarecele nu este un model adecvat de studiu al efectelor determinate de consumul de lactoser, prin comparație cu șobolanii, în cazul cărora cantitățile de EZ consumate, raportat la greutatea corporală, erau mult mai mari. Rezultă că Eco-Zonarul, în toate cele 3 variante, poate fi consumat fără riscuri, existând premisele unor posibile efecte benefice pentru sănătatea animalelor și prevenirea îmbolnăvirilor.

A3.2) Studiul proprietăților antioxidante ale Eco-Zonarului pe un model de stres oxidativ indus experimental la șobolani Wistar (chimioterapie cu Doxorubicină și Carboplatin);

Studiul proprietăților antitoxice ale Eco-Zonarului (Zonar cu Ghimbie și Miere) a fost realizat pe un model animal (șobolani Wistar) tratat cu concentrații diferite de Doxorubicina și Carboplatin, două chimioterapice utilizate frecvent în terapia unor forme de cancer epitelial. Studiul a fost realizat pe un număr de 30 femele adulte (Wistar), cazate în Biobaza FMV Cluj-Napoca, hrănite cu furaj granulat combinat (furnizor Institutul Cantacuzino, Bucurește) în cantitate de 20 g/animal/zi, și beneficiind de o alternanță zi/noapte de 12 ore. Loturile şi tratamentele aplicate au fost efectuate după cum urmează: Lotul 1 (n=5) Martor (furaj și apă ad libitum) pentru obținerea valorilor de referință; Lotul 2 (n=5) a primit Doxorubicină în cantitate de 10 mg/kg, respectiv furaj 20g/animal/zi și apă ad libitum; Lotul 3 (n=5) a fost tratat cu Doxorubicină (10 mg/kg+EZ) și a primit o cantitate de 30 ml EZ/animal/administrare (90 ml/animal/zi); Lotul 4 (n=5) a fost tratat cu Carboplatin, în doză de 40 mg/kg, și a primit 20 g/furaj/animal/zi și apă ad libitum; Lotul 5 (n=5) a fost tratat cu Carboplatin în cantitate de 40 mg/kg+EZ, și a primit 20g/furaj/animal/zi, iar Lotul 6 (n=5) a fost tratat cu o concentrație mai mare de Carboplatin (60 mg/kg+EZ), primid 20 g nutreț granulat combinat și lactose cu ghimbir și miere (30 ml/animal/administrare=90 ml/animal/zi). Citostaticele (Doxorubicina și Carboplatin ) au fost administrate intraperitoneal in ziua 1 și 7, în dozele menționate. Prosdusul Eco Zonar (EZ) a fost administrat zilnic, de 3 ori pe zi, câte 150 ml/lot/administrare. Toate loturile au fost hrănite cu 20g/animal/zi hrană (100g/lot) standard pentru rozătoare (Institutul Cantacuzino, București).

Cantitatea de hrană și EZ administrată și consumată au fost notate zilnic. Masa corporală individuală a fost determinată şi înregistrată din 2 în 2 zile pe parcursul perioadei experimentale , apoi diferenţele de greutate au fost calculate ulterior folosind formula: (detalii tehnice în Anexa 5)

Variaţie masa corporala(%) = 100 * (m. c.finala − m. c.iniţiala) / (m. c. iniţiala)

În ziua 7 și 14 s-au recoltat probe de sânge din sinusul retroorbital sub narcoză, pentru examen hematologic (hemoleucograma) și plasmă pentru examenul biochimic (glicemia, proteinograma și profilul lipidic), respectiv pentru determinarea stresului oxidativ. Determinările hematologice au fost realizate cu ajutorul analizorului automat Abacus Junior Vet, Diatron Messtechnik ®, din probe de sânge recoltate pe anticoagulant (EDTA). Pentru determinările biochimice, probele de sânge au fost centrifugate imediat după recoltare. După separarea serului, probele au fost congelate imediat în flacoane tip Eppendorf. Determinările biochimice (Proteine totale, albumina, ALAT, ASAT) au fost realizate cu analizorul semiautomat pentru biochimie tip screen point (STAT-FAX 1904 Plus), cu reactivi specifici (Diachem). Globulinele au fost determinate prin calcularea diferenței dintre valoarea proteinelor totale și valoarea Albuminelor, iar raportul A/G a fost calculate pentru toate animalele.

Rezultate preliminare

În tabelul 1 (Anexa 5) este prezentată cantitatea de hrană consumată pe loturi și pe zilele experimentului, valorile fiind exprimate în grame. Se observă o reducere drastică a cantității de hrană după administrarea de citostatice mai ales la loturile tratate cu Doxorubicină (Lot 1 și 2). În cazul lotului 2, animalele au consumat doar 15 g de hrană, care reprezintă 31,91% din hrana consumată din ziua anterioară. În cazul lotului 3, animale care au beneficiat și de administrare de EZ, cantitatea de hrană ingerată a fost de 52% din cantitatea consumată în ziua precedent. După a doua administrare scade din nou cantitatea de hrană consumată. În ziua 6 a murit 1 șobolan din lotul 3 (Doxo+EZ) și 2 șobolani din lotul 6 (Carboplatin 60 mg+EZ). Până la sfârșitul experimentului au rămas doar 2 indivizi în lotul 2, 3 în lotul 3 și 2 animale în lotul 2. Reducerea consumul de hrană la loturile 2,3,6 se datorează și faptului ca s-a redus numărul de animale pe lot. La loturile tratate cu Carboplatin se observă reducerea consumului de hrană după administrarea citostaticului (ziua 2), doar din ziua 3. Scăderea cantității de hrană se observă și după a doua administrare de citostatice (ziua 7).

În ceea ce privește consumul de Zonar cu ghimbir și miere (EZ), se observă că cea mai mare cantitate de EZ a fost consumată de lotul 5 (Carboplatin 40mg+EZ), iar cea mai mică de lotul 6 (Carbo 60mg+EZ). Consumul mediu este ilustrat în tabelul 2 (Anexa 5.2), și se referă la consumul mediu de EZ per administrare, ceea ce înseamnă ca lotul 5 a consumat aproximativ 100 ml pe zi/pe lot.
Consumul scăzut la lotul 6 se datorează și faptului că din ziua 6 s-a redus numărul de animale pe lot.

În ce privește rezultatele examenului hematologic (detalii în Anexa 5), se constată scăderea numărului de leucocite la toate loturile tratate cu citostatice la 7 zile post inoculare. Cele mai mici valori se observă la loturile tratate cu Doxorubicină (lot 2 și 3) și Carboplatin 60 mg (L6) . Această scădere se produce din cauza medulotoxicității, care este un efect secundar cunoscut al citostaticelor. La lotul 2 se observă o scădere cu -80.29% a numărului de leucocite comparativ cu lotul martor, respectiv -75.61% în cazul lotului 6. Aceste diferențe procentuale sunt semnificative statistic (p<0,05). La toate loturile tratate numărul leucocitelor scade sub limita normală sau aproape de limita inferioară (lotul 5), reprezentând manifestări specific pentru leucopenie. La sfârșitul experimentului (ziua 14) valoare leucocitelor ajunge în limite normale la loturile experimentale, exceptând lotul 6, la care se observă o leucocitoză marcantă (38,28±7,8 x 109/L), valoare mai crescută cu 212,64% față de lotul martor. Acestă creștere se produce pe seama creșterii ponderii granulocitelor neutrofile, fapt ce constituie indiciul unei reacții inflamatorii pe fondul struslui oxidative puternic produs de citostatice.

Determinarea valorilor markerilor inflamației la loturile experimentale a constat în evaluarea concentrațiilor de fibrinogen și haptoglobină (detalii în Anexa 5), notându-se o creștere a cantității de fibrinogen la loturile tratate cu citostatice în ziua 7, față de lotul martor, cea mai mare diferență (+108.94%) înregistrându-se la lotul 2, în cazul căruia concentrația fibrinogenului (341,4±71,58 mg/dl) depășește limita superioară normal a speciei (210-267mg/dl). În cazul loturilor 3, 4, 5 valoarea fibrinogenului se încadrează în limitele de referințe iar la lotul 6 se observă valori mai scăzute (131,33±88,04). Valoarea scăzută a cantității de fibrinogen poate să apară în tulburări severe ale funcției hepatice (ex: insuficiență hepatică) sau în cazul unor coagulopatii de consum (ex: CID).

În ceea ce privește concentrația haptoglobinei, cele mai mari valori se observă la lotul 4 (59,55±10,55 mg/dl) și lotul 6 (94,93±22,27 mg/dl), față de lotul martor (20,10±1,6 mg/dl) și față de valorile descrise în literatură (10-35 mg/dl). Haptoglobina face parte din categoria proteinelor de fază acută (ƴ2 globuline) și împreună cu fibrinogenul reprezintă un marker specific al inflamației și strusului oxiidativ la șobolani. Valoarea crescută a haptoglobinei la lotul 6 (Carbo 60 mg+EZ) se corelează cu valoarea crescută a numărului total al leucocitelor la acest lot, modificări care indică un răspuns inflamator sistemic, care poate sa fie indus de administrarea repatată de Carboplatin în doză mare (60 mg/kg). Carboplatinul în doză de 60mg/kg a determinat creșterea mortalității și la afectarea hepatică la animalele din lotul 6 care au supraviețuit până la sfâșitul experimentului. Suferința hepatică este sugerată de creșterea valorii parametrilor funționali/enzimatici hepatici (Tabel 8 din Anexa 5) și de creșterea greutății ficatului. Referitor la cântărirea organelor la sacrificare, se observă o diferență procentuală de 83,86% la greutatea ficatului la lotul 6 (11,68±0,95 g) față de lotul martor (7,35±1,0 g). Creșterea enzimei aspartat alaniltranferazei (ALAT) este un indicator specific injuriei hepatobiliare la șobolani, modificare toxică care poate să fie indusă de administrarea repetată de citostatice (ex: Carbolpatin). În cazul lotului 5 (Carboplatin 40mg+EZ) se poate observa o diminuare al efetului toxic indus de chimioterapic, probabil datorită consumului relativ mare (cca. 100 ml/zi) de EZ. Efectul protectiv s-a manifestat prin creșterea greutății corporale datorită stimulării apetitului, având în vedere că la acest lot s-a înregistrat cea mai mare cantitate de furaj consumată pe parcursul perioadei experimentale. La acest lot nu se observă leucopenia caracteristică în ziua 7 al experimentului, valorile leucocitelor fiind scăzute (4,34±1,71), însă în intervalul de referință. La lotul tratat doar cu Carboplatin se observă o leucopenie, valoare leucoitelor totale fiind de 2,05±1,7x109/l. În ceea ce privește valoarea haptoglobinei, la lotul 5 s-au înregistrat valori normale ale acestuia comparativ cu celelate loturi supuse tratamentului cu carboplatin, unde s-a remarcat o creștere semnificativă, diferența între lotul 4 și 5 fiind foarte semnificativă statistic (p<0,001). Acest efect protector se poate datora conținutului mare al EZ în aminoacizi cu catenă ramificată (ex: cistină/cisteină și γ-glutamilcistină), care reprezintă un substrat foarte important pentru sinteza glutationului și a glutation-peroxidazei. Glutationul este un antioxidant omniprezent care, direct sau prin intermediul enzimelor asociate, distruge radicalii liberi, detoxifică carcinogeni, menține proteinele într-o stare funcțională și asigură un sistem imunitar eficient.

Concluzii

Rezultatele acestui studiu evidențiază efectul deosebit de toxic al citostaticelor din categoria Doxorubicinei și Carboplatinului asupra șobolanilor Wistar, în funcție de doza administrată, dar și de utilizarea unor produse cu posibil efect protector, cum este Eco-Zonarul (Zonarul cu ghimbir și miere). Efectul protector al consumului de EZ în contextul unei chimioterapii cu Doxorubicină și Carboplatin este ilustrat de evoluția favorabilă a consumului de furaj și implicit a greutății corporale la animalele, însă la concentrații mari ale carboplatinul acest efect protector nu mai este atât de evident. Referitor la stresul oxidativ indus de chimioterapie și la sindromul inflamator consecutiv, s-au notat de asemenea prezența unor efecte protectoare al EZ, exprimate prin reacții medulare mai puțin agresive, un tablou hematologic care se încadrează în limite normale (sau se manifestă prin leucocitoză), și un profil biochimic caracterizat prin valori ale proteinogramei puțin modificate, exceptând fibrinogenul și haptoglobina, care sunt semnificativ crescute la loturile tratate cu citostatice, însă semnificativ mai mici în cazul loturilor tratate cu Doxorubicină și Carboplatin care au consumat produsul Eco-Zonar.

A3.3) Studiul proprietăților detoxifiante ale Eco-Zonarului pe un model de chimioterapie cu doxorubicină în carcinomul de colon C26 inoculat la șoareci din linia BALBc

Pentru studiul proprietăților detoxifiante al Eco-Zonarului a fost utilizat un model animal constând în terapia cu Doxorubicină la șoareci BALB/c inoculați subcutanat cu celule de carcinom de colon C26. Metoda de inducere a carcinomului de colon C26, incluzând prepararea și administrarea celulelor tumorale este prezentată în detaliu în Anexa 6.1, în care sunt detaliate aspecte legate de lotizarea animalelor, condițiile de cazare, regimul alimentar și tratametele efectuate cu Doxorubicină. Experimentul a fost aprobat de Comisia de Bioetică a USAMV Cluj-Napoca (Decizia nr : 00/00/0000) și autorizat de DSVSA Cluj (Autorizație de proiect Nr. 93 din 20.11.2017). Pentru evaluarea efectelor detoxifiante și antiproliferative, a fost utilizat prodsul Eco-Zonar (EZ) și produsul liofilizat obținut din Zonar (CpZ) prin liofilizare, care au fost administrate zilnic, conform protocolului descris în Anexa 6.1).

Carcinomul de colon C26 este utilizat atât pentru testarea moleculelor antiproliferative, cât și pentru studiul cahexiei tumorale (Aulino și col, 2010). Cahexia este un sindrom metabolic complex, întâlnit în etapele terminale ale neoplaziilor, în special în cazul carcinoamelor, datorată proliferării tumorale expansive, dar și efectelor negative a chimioterapicelor (Toledo și col, 2014). Studiile realizate pe C26 arată că mecanismul principal implicat în cahexie este catabolismul proteic și consumul proteinelor structurale, distrofie/atrofie musculară și scăderea severă a masei corporale, efecte determinate de produșii toxici eliberați de tumoră, dar și de chimioterapicele utilizate (Aulino și col, 2010). Metodele de control a cahexie tumorale datorată toxinelor studiate pe modelul murin de C26 sunt variate și includ terapii cu molecule chimice (ex: indometacin, ibuprofen), stimulante ale apetitului, eritropoietină (McCarthy și col, 2004). Alte metode sunt reprezentate de dietele alimentare, cum ar fi hrana hiperproteică (al-Majid și col, 2001) sau produsele nutraceutice.

Referitor la evoluția în dinamică a greutății experimentale la loturile experimentale, s-a observat o creștere ușoară pe tot parcursul experimentului a greutății la loturile 1 (20.8±2.16 g/lot), 2(21.8±1.09 g/lot) și 3(23.4±1.67 g/lot). La lotul 3 (23.4±1.67 g/lot) hrănit cu EZ și CpZ s-a evidențiat o creștere a masei corporale în comparație cu lotul martor (20.8±2.16 g/lot) la finalul experimentului. La lotul 4 se observă o scădere a greutății corporale la T4 (-19.6±1.14 g/lot) față de T3 (-20.6±0.54 g/lot) și lotul martor (20.8±2.16). La loturile tumorale hrănite cu dietă bazată pe EZ și CpZ se observă o creștere prpogresivă a masei corporale pe tot parcursul experimentului, greutățile șoarecilor ajungând la 21±1 g/lot (L5) și 21.4±1.94 g/lot (L6) după 25 de zile post inoculare. Menținerea greutății corporale a șoarecilor pe parcursul experimentului atestă valoarea nutritivă a produselor pe bază Zonar. Nu s-a observat nici scăderea semnificatiivă a greutății corporale (cahexia tumorală) după ziua 14, probabil datorită aportului suplimentar de aminoacizi esențiali, albumine și globuline prin produsele studiate.

În cazul C26, creșterea tumorală are loc în 2 faze (Aulino și col, 2010). Prima fază durează 14 zile și este caracterizată printr-o creștere lentă, după care urmează o fază de creștere tumorală expansivă, cu tumori care depășesc 2 g. Și au un volum mai mare de 200 mm3. Refreitor la volumul tumoral se evidențiază o creștere progresivă a acestui parametru la loturile tumorale în primele 21 de zile. Totuși se poate observa o scădere a volumului tumoral la lotul 5 (262.95±175.25 mm3) și 6 (260.1±113.74 mm3), față de lotul 4 (472.95±220.35 mm3) în ziua 21. Totodată se observă o scădere semnificativ statistică a volumului tumoral la animalele din loturile 5 (650.52±244.29 mm3 ) și 6 (698.45±114.28 mm3) prin comparație cu lotul tumoral la 25 de zile post inoculare C26 (p≤0.001).

Această scădere a volumului tumoral poate fi rezultatul dietei cu Eco-Zonar (Anexa 6.2), cât și a celor 3 zile de dietă șoc, bazată pe consumul exclusiv de Eco-Zonar și Zonar liofilizat (fără aport de furaj granulat). Dieta de șoc a fost implementată cu scopul de a produce un șoc metabolic bazat pe restricție calorică, menit să afecteze creșterea și dezvoltarea tumorală. Efectul antitumoral al dietei este evident începând cu ziua 14, rezultând astfel că efectele benefice ale consumului de EZ apar după cel puțin 14-21 zile de consum. Mecanismul antitoxic și antiproliferativ prin care pare că acționează EZ și Zonarul liofilizat poate fi atribuită stimulării sintezei glutation-peroxidazei (GPx), datorită aportului suplimentar de aminoacizi cu catenă ramificată de tipul cisteinei, leucinei și izoleucinei, glutaminei și valinei, dar și stimulării funcției efectorilor celulari și umorali ai imunității specifice prin surplusul de α-lactoglobulina, β-lactoglobuline și imunoglobuline (Bounous și col., 2000).

Nu s-au observat diferențe semnificativ statistice în ceea ce privește greutatea carcasei la loturile inoculate cu C26, dar s-a observat o creștere ușoară a acesteia la loturile 5 (20.01±1.15 g/lot) și 6 (20.91±2.06 g/lot) față de lotul 4 (19.73±1.15 g/lot). În schimb, în ceea ce privește volumul tumoral, la lotul 5 (0.38±0.19) se observă o scădere semnificativă față de lotul 4 (0.66±0.20 g/lot) (p≤0.01).

Determinarea parametrilor leucocitari semnalează o creștere a numărului total de leucocite (9.42±4.39) la lotul 3, realizată pe seama creșterii numărului de limfocite (4.63±2.01), față de lotul martor (WBC=5.5±0.60 x109/L, LYM=1.96±0.66 x109/L). Toți parametrii leucocitari la loturile 1, 2 și 3 se încadrează în limitele normale ale speciei. La lotul 4 (3.98±1.73 x109/L), lotul 5 (4.43±0.82 x109/L) și lotul 6 (4.55±1.32 x109/L) șe observă o scădere a numarului total de leucocite, sub valorile fiziologice ale speciei dar și prin raportare la lotul martor (5.5±0.60 x109/L). Această scădere este determinată de limfopenia loturilor 4 (2.71±1.13 x109/L), 5 (2.66±0.65 x109/L) și 6 (2.30±0.50 x109/L), tulburare care însoțește cel mai probabil imunosupresie cauzată de dezvoltarea tumorală.

Rezultatele obținute la determinarea parametrilor eritrocitari (RBC, HGB ȘI HCT) și trombocitari (PLT) se încadrează de asemenea în limitele de oscilație normale pentru această specie, iar la loturile tumorale nu se constată diferențe marcante față de lotul martor (detalii în Anexa 6.2).

Determinarea creatin-kinazei (CK) și fosfatazei alcaline (PAL) ca indicatori ai reactivității celulare în cazul unor distrucții tisulare provocate de creșterea tumorală, semnalează valori ridicate ale CK datorate leziunilor degenerative sau necrozante provocate de injuriile mușchilor striați. Se observă o creștere semnificativă a CK la lotul 4 (2023.28±484.80 U/L) în comparație cu lotul 1 (463.86±251.18 U/L) (p≤0.001), dar și față de lotul 5 (1191.24±233.83 U/L) (p≤0.05) și lotul 6 (1327.96±241.85 U/L) (p≤0.05). Totodată se observă și o scădere procentuală a CK la loturile hrănite cu EZ (-83.49%) și Zonar liofilizat (-34.37%) în comparație cu lotul 4. Acest fapt poate atesta efectul protector al Eco-Zonarului cu privire la leziunile musculare provocate de creșterea expansivă a carcinomului C26. În principiu, stadiile tardive ale dezvoltării C26 la șoareci se caracterizează prin manifestări de sarcopenie și atrofie musculară, iar aportul suplimentar de proteine bioactive realizat prin consumul de EZ și Zonar liofilizat previne atrofia mușchilor striați. La rândul ei, creșterea sintezei de PAL este asociată cu stadiile terminale ale cancerului de colon, creșterea semnificativă a acestei enzime fiind semnalată la pacienții cu metastaze hepatice (Saif et al, 2005). Și în acest caz se observă o creștere a PAL la lotul 4 în comparație cu lotul martor, și o scădere % a concentrației plasmatice a PAL la loturile 5 (-50.82%) și 6 (-30.05%) prin comparație cu lotul 4 (C26) (detalii în Anexa 6.2).Concluzii

Experimentul demonstrează posibilul efect protector al consumului de Eco-Zonar și de concentrat obținut din zonar prin liofilizare asupra manifestărilor toxice provocate de dezvoltarea tumorală expansivă și respective de administrarea citostaticelor de tipul Doxorubicinei. Acest effect protector se exprimă atât printr-o conservare a masei musculare striate în stadiile tardive de evoluție a carcinomului C26, cât și prin valori ale parametrilor celulari și biochimici sanguini. Este afectată, de asemenea, proliferarea tumorală, în sensul că la animalele care au consumat EZ și zonar liofilizat se înregistrează diferențe % negative ale volumului tumoral la loturile experimentale compartv cu lotul 4 sau martorul tumoral. Aceste diferențe se mențin și pentru greutatea tumorilor determinată la sfârșitul experimentului, respectiv pentru raportul care se stabilește între volumul tumoral și greutatea carcasei.

A3.4) Studiul proprietăților imunostimulatoare (specifice și nespecifice) ale dietei cu Eco-Zonar pe șoareci CD4 inoculați intraperitoneal cu tumora ascitogenă Ehrlich (EAC);

Ascita Ehrlich (EAC) este o tumoră transplantabilă de origine epitelială (adenocarcinom mamar), menținută prin pasaje seriate la șoareci. EAC este utilizată în oncologia experimentală, pentru a studia influența stresului asupra dezvoltării tumorale kaligne, răspunsul imunologic al gazdei la creșterea tumorală, evaluarea particularităților creșterii tumorale în relație cu administrarea extractelor vegetale, medicamentelor antiinflamatorii, agenților chimici derivați din fluorouracil și cisplantin, sau a vitaminelor A și B1 (Palermo-Neto și colab., 2003). Grefată intraperitoneal, EAC se dezvoltă ca o ascită în care celulele tumorale plutesc libere într-o masă de lichid asemănătoare, din punct de vedere al compoziției chimice, serului normal de șoarece. După inocularea ip, celulele EAC cresc în 2 faze: 1) o fază proliferativă în care numărul celulelor crește exponențial ; 2) o fază de platou, urmată de o perioadă de liniște, în care numărul de celule rămȃne aproape constant. Celulele EAC cresc printr-o diviziune celulară rapidă în timpul etapei de proliferare, iar acumularea de fluid ascitic se produce în paralel cu proliferarea celulelor tumorale. După un interval de 14-21 de zile de la inoculare, animalulgazdă moare datorită presiunii exercitate de acumularea lichidului tumoral, respectiv datorită efectelor imunosupresive provocate de agresivitatea tumorală. Pentru realizarea acestui experiment s-au folosit 35 de şoareci adulți, femele, din linia Swiss, care au fost distribuiți în 7 loturi experimentale. Detaliile cu privire la lotizare, cazare, furajare, metoda de preparare și de administrare a celulelor EAC, protocolul experimental, investigațiile efectuate și rezultatele preliminare sunt prezentate în Anexa 7.

În ziua 14 s-au recoltate probe de sânge din sinusul venos retro-orbitar sub narcoză cu izofluran, apoi animalele au fost eutanasiate. S-a recoltat şi măsurat lichidul ascitic prezent în cavitatea peritoneală, după care lichidul obținut a fost transferat în soluţie tampon fosfat (PBS) la 4ºC şi pH=7,4. Viabilitatea celulelor tumorale din lichidul ascitic a fost evaluată prin coloraţia cu albastru de Tripan (0,4% în PBS), determinând numărul total de celule tumorale şi numărul de celule tumorale viabile, cu ajutorul camerei de numărat Bürker (diluţie de 1:10). Din lichidul ascitic s-au efectuat frotiuri care au fost colorate prin metoda Dia Quick Panoptic, apoi au fost analizate la microscop cu obiectiv de imersie (x100). Celule prezente pe frotiuri au fost clasificate ca: celule tumorale, neutrofile, monocite şi limfocite, pe baza caracterelor morfologice. Procentul fiecărui tip de celule prezente în lichidul ascitic a fost calculat prin raportare la numărul total de celule tumorale Ehrlich, după formula:

Celule (10⁶/ml) (în lichid ascitic) = (celule(%) * celule EAC (10⁶/ml)) / 100

Determinările hematologice au fost efectuate cu ajutorul analizorului automat Abacus Junior Vet, Diatron Messtechnik ®, din sângele recoltate pe anticoagulant (EDTA). Pentru toate determinările biochimice, probele de sânge au fost centrifugate imediat după recoltare. După separarea serului, probele au fost congelate în flacoane tip Eppendorf. Determinările biochimice (Proteine totale, albumina, ALAT, ASAT) au fost realizate cu analizorul semiautomat pentru biochimie tip screen point (STAT–FAX 1904 Plus), utilizând reactivi specifici (Diachem) pentru fiecare determinare. După eutanasierea animalelor s-a realizat examenul necropsic, s-a recoltat măduvă osoasă hematogenă din femur, și respectiv splina pentru evaluarea CFU-GM (colony forming units-granulocyte macrophage).

Analiza rezultatelor obținute (Anexa 7) nu a evidențiat diferențe asigurate statistic în ceea ce privește evoluția greutății corporale la loturile experimentale, exceptând desigur loturile inoculate cu EAC. Referitor la rezultatele determinărilor hematologice, Doxorubicina administrată la lotul 6 a indus o leucopenie semnificativă (4,25±0,64x109/L) prin comparaţie cu lotul martor (7,24±1,73x109/L). Leucopenie se observă și în cazul lotului 7 (EAC+EZ), fiind determinată de scăderea numărului de limfocite. Leucocitoza marcantă observată la lotul 4 (29,26±19,86x109/L) se datorează foarte probabil sindromului inflamator sistemic provocat de dezvoltarea tumorii ascitogene. In tabelul 4 (Anexa 7) sunt prezentate rezultatele examenului citologic al lichidului ascitic la animalele inoculate cu EAC.

La animalele din lotul tratat cu Doxorubinină nu s-a observat formarea și acumularea de lichid ascitic. La sfârșitul perioadei experimentale doar 3 animale erau în viață din lotul 4 (EAC), 2 din lotul 7 (EAC+EZ), și nici un animal din lotul 6 (EAC+Doxo+EZ). Dezvoltarea tumorii a fost urmată de o creştere semnificativă a greutății corporale din cauza acumulării intraperitoneale a lichidului ascitic. Administrarea de Doxorubicină a avut un efect protector semnificativ, animalele din lotul 7 prezentând o uşoară scăderea a greutății corporale spre sfârşitul experimentului. Cea mai mică cantitate de lichid ascitic (1,35±0,49 ml) a fost determinată la lotul 7 (EAC+Doxo+EZ), iar cel mai scăzut număr de celule tumorale viabile în lichidul ascitic (1,2 x 106/ml) s-a înregistrat la lotul tumoral (4).

Concluzii
Rezultatele experimentale au evidențiat caracterul deosebit de agresiv al dezvoltării celulelor EAC la animalele inoculate intraperitoaneal, și faptul că administrarea doxorubicinei combinată cu consumul de EZ inhibă rata de proliferare tumorală, în timp ce consumul exclusive de EZ nu pare să influențeze în vreun fel rata de proliferare a celulelor tumorale. Acest din urmă aspect ar putea fi și rezultatul unui interval de timp foarte scurt în care s-a realizat studiul (14 zile), dar și consecința faptului că agresivitatea celulelor tumorale este foarte pronunțată, iar peptidele bioactive din EZ nu au timp suficient pentru a induce o remodelare a mecanismelor de apărare antitumorală.

Concluzii generale

1. A fost efectuată caracterizarea și măsurarea cantitativă a componentelor funcționale nutraceutice din Zonarul cu ghimbir și miere (Eco-Zonar), respectiv proprietățile fizico-chimice ale acestuia, prin analiza HPLC și realizarea cromatogramelor proteinelor bioactive, lactozei și a nitriților/nitraților de Na. De asemenea, a fost realizat în cadrul acestui obiectiv studiul in silico al proteinelor/peptidelor din Eco-Zonar, rezultatele confirmând prezența macropeptidelor biologic active, și implicit proprietățile funcționale nutraceutice deosebite ale Zonarului cu ghimbir și miere polifloră.
2. A fost determinat raportul optim dintre componentele care intră în alcătuirea produsului final (Eco-Zonar), în ce privește cantitatea de Zonar (8,84 litri), extract concentrate din rădăcină de ghimbir (1 litru) și mierea (0,16l/160 g miere), atât prin utilizarea referințelor din literatura de specialitate, cât și prin încercări repetate ale producătorului de a obține un produs cu proprietăți organoleptice deosebite.
3. A fost efectuat studiul proprietăților biologic active a 3 variante de Zonar cu ghimbir și miere (preparate și selecționate de producător) pe 3 modele in vivo realizate pe șobolani Sprague-Dowley, șoareci CD4 femele și șoareci CD4 masculi. Rezultate obținute confirmă absența manifestărilor patologice în urma consumului zilnic de EZ la șobolani și la șoareci. Parametri clinici, hematologici și biochimici evaluați susțin existența unor posibile efecte funcționale benefice pentru sănătatea animalelor.
4. Au fost investigate proprietățile antioxidante ale Zonarului cu ghimbir și miere selectat de producător (EZ1), pe un model de stress oxidativ indus la șobolani Wistar prin administrarea unor concentrații diferite de citostatice (Doxorubicină și Carboplatin). Sindromul inflamator sistemic indus de stresul oxidativ a fost evaluat prin evaluări clinice și determinarea parametrilor celulari (WBC, RBC) și biochimici sanguini (ex: fibrinogenul, haptoglobina, ASAT, ALAT), rezultatele obținute confirmând proprietățile funcționale (protectoare) ale EZ1, și implicit rolul său în conservarea homeostaziei.
5. Studiul proprietăților detoxifiante și antiproliferative ale Eco-Zonarului a fost realizat pe un model de chimioterapie cu doxorubicină la șoareci BALB/c inoculați cu celule de carcinom C26, rezultatele clinice, hematologice și biochimice prezentate și discutate relevând un posibil efect protector al EZ împotriva acțiunii toxice a doxorubicinei, dar și a toxinelor produse în stadiile terminale ale C26. 6) Studiul proprietăților imunostimulatoare ale dietei cu Eco-Zonar a fost realizat pe șoareci CD4 inoculați cu tumora ascitogenă Ehrlich, însă rezultatele clinice, hematologice și biochimice obținute sunt contradictorii, în sensul că presupusul efect imunostimulant al peptidelor bioactive din EZ nu s-a manifestat în nici un fel, probabil datorită ritmului fulminant în care s-au dezvoltat tumorile ascitice.